聲光可調(diào)-近紅外光譜技術(shù)快速分析 復(fù)方參片中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的新方法

[摘要]??? 目的：建立一種用聲光可調(diào)（AOTF）-近紅外（NIR）光譜技術(shù)快速測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的新方法。方法：依據(jù) 2005 版《中國(guó)藥典》復(fù)方丹參片含量測(cè) 定方法,以 HPLC 測(cè)定其丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的含量，運(yùn)用偏最小二乘(PLS1)法建立 NIR 光 譜與 2 成分 HPLC 分析值之間的多元校正模型,對(duì)未知樣品進(jìn)行含量預(yù)測(cè).結(jié)果：建立的定量 模型準(zhǔn)確性好，丹參酮ⅡA.丹酚酸 B 的內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差分別是 RMSECV=0.0103， RMSECV=0.1868，決定系數(shù)分別是 R2=0.987 3, R2=0.9832，并對(duì)外部驗(yàn)正集樣品進(jìn)行外部驗(yàn) 證，丹參酮ⅡA. 丹酚酸 B 預(yù)測(cè)值與真值的相關(guān)系數(shù)分別是 R=0.974 3， R=0.988 6,.該方 法的精密度.穩(wěn)定性好,RSD 分別是 1.756%, 1.980%和 1.193%,1.869%,預(yù)測(cè)回收率是 103.0%， 99.0%。

結(jié)論：AOTF–近紅外光譜法對(duì)復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 含量預(yù)測(cè)結(jié)果較好,為中藥生產(chǎn)過(guò)程的在線、無(wú)損定量分析提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]??? 聲光可調(diào)濾光器；近紅外光譜技術(shù)；復(fù)方丹參片；丹參酮ⅡA ；丹酚酸 B ； 偏最小二乘法(PLS)

復(fù)方丹參片是活血化瘀,理氣止痛的常用中成藥，由丹參、三七、冰片三味藥組成，大 量的藥理實(shí)驗(yàn)證明丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 具有改善心肌缺血,清除自由基等作用,是丹參藥效 的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。2005 版《中國(guó)藥典》以 HPLC 測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的含量[2]，操做煩瑣,分析周期長(zhǎng)。目前在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)由于不同廠家、不同批號(hào)復(fù)方丹 參片中藥效成分含量變化幅度較大,致使藥品質(zhì)量和療效存在很大的差異[3], 因此，當(dāng)前迫 切需要發(fā)展一種快速、高效、并適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的新型分析測(cè)試技術(shù)，研究建立復(fù)方丹參片快 速評(píng)價(jià)方法和適應(yīng)于生產(chǎn)過(guò)程的在線質(zhì)量監(jiān)控方法。

近紅外(NIR)光譜法是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種綠色分析技術(shù)，并以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)開(kāi)始應(yīng) 用于中藥分析 [4-7], 以往多采用傅立葉變換近紅外光譜儀。20 世紀(jì) 90 年代末出現(xiàn)了第 5 代 聲光可調(diào)（AOTF）近紅外光譜儀，被稱(chēng)為“90 年代近紅外光譜儀最突出的進(jìn)展”。這種新 型的近紅外光譜儀具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積小、重現(xiàn)性好和儀器環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，將過(guò)去必 須在室內(nèi)，且對(duì)溫度、濕度、灰塵、防震均有嚴(yán)格要求的各項(xiàng)檢測(cè)轉(zhuǎn)移到了生產(chǎn)在線和現(xiàn)場(chǎng)

（室外）。最近幾年，AOTF-近紅外光譜分析儀引進(jìn)國(guó)內(nèi)，已開(kāi)始應(yīng)用于煙草及化工行業(yè)[8]，

本研究采用聲光可調(diào)濾光器近紅外（AOTF-NIR）光譜分析技術(shù),建立快速、同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參片中藥效成分丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 含量的新方法。該方法操作簡(jiǎn)便、分析迅速, 體現(xiàn)了 AOTF-NIR 光譜分析技術(shù)可用于現(xiàn)場(chǎng)快速分析的特點(diǎn)，為復(fù)方丹參片的快速定量分析和生產(chǎn) 過(guò)程中的在線檢測(cè),控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有效的分析方法。

1??? 儀器與試藥

AOTF 便攜式 Luminar5030-731 近紅外光譜分析儀（美國(guó) BRIMROSE 公司），用于靜止檢 測(cè)的 30 mm 有機(jī)玻璃樣品槽(槽深 8 mm)和有機(jī)玻璃支架，配套使用的 SNAP 光譜采集軟件和 CAMO 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件。Waters1525 色譜儀（美國(guó) Waters 公司），Waters 2996 二極管陣列 檢測(cè)器，Empower 色譜工作站。

對(duì)照品丹酚酸 B（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 111562-200504 供含量測(cè)定用）；丹參 酮ⅡA（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110766-200417 供含量測(cè)定用）；復(fù)方丹參片（濟(jì)南 宏濟(jì)堂制藥有限公司提供）；甲醇為色譜純?cè)噭?；水為超純水?/p>

2??? 方法

2.1 ?收集樣品

為消除建摸樣品的含量范圍和分布對(duì)所建校正模型性能的影響,本研究中,除濟(jì)南宏濟(jì) 堂制藥有限責(zé)任公司提供的不同批號(hào)復(fù)方丹參片樣品以外,還摸擬車(chē)間生產(chǎn)條件在實(shí)驗(yàn)室制 備部分樣品以拉大含量分布范圍.共收集樣品 57 批,將 57 批樣品分為校正集和驗(yàn)證集,其中 驗(yàn)證集 5 批均來(lái)自濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥有限公司。

2.2 ?HPLC 分析

將上述 57 個(gè)樣品按 2005 版《中國(guó)藥典》復(fù)方丹參片項(xiàng)下含量測(cè)定方法,采用 HPLC 測(cè) 定樣品中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 含量，每份樣品重復(fù)測(cè)定 3 次，相對(duì)偏差小于 1.5%，以 3 次 含量測(cè)定結(jié)果的平均值為樣品中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的含量。

2.3 近紅外光譜采集

每次取不同批次的樣品 10 片，研磨成粉狀（過(guò) 80 目篩），分別倒入 30 mm 的有機(jī)玻璃樣品槽中，用專(zhuān)用的有機(jī)玻璃槽蓋將樣品表面抹平，在 1 100－2 300 nm 間掃描，掃描間隔為 2.0 nm，掃描平均次數(shù)為 100 次。每個(gè)樣品測(cè)一次，得到 57 個(gè)樣品的總光譜圖，見(jiàn)圖 1。

3??? 結(jié)果與討論

3.1 ?光譜預(yù)處理

在建立模型前，首先對(duì)掃描得到的原始吸收光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理，以消除噪音和基線漂移的影響。我們采用的預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù) 9 點(diǎn)平滑法（savitzky-golay）。一階導(dǎo)數(shù)光 譜圖見(jiàn)圖 2。經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理可以很好的消除樣品由于顏色差別引起的光譜基線偏移和漂移。

3.2??? 建立 PLS1 數(shù)學(xué)模型

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)與 PHLC 分析數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法（PLS1），交 叉－驗(yàn)證法（cross-validation），用 The Unscrambler 定量分析軟件建立模型。NIR 和 HPLC 測(cè)定的異常值分別采用光譜影響值 Leverage 和化學(xué)值誤差 Residual 這兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)剔 除。經(jīng)過(guò)異常值的剔除進(jìn)行優(yōu)化，得到了較為理想的校正模型,見(jiàn)圖 3，4。

由圖 3.4 可見(jiàn)，通過(guò) PLS1 方法建立的(NIR)光譜校正模型,得到的樣品丹參酮ⅡA 和丹 酚酸 B 的 NIR 光譜預(yù)測(cè)值與 HPLC 分析值之間相關(guān)性良好,測(cè)定數(shù)據(jù)偏差較小。丹參酮ⅡA 模 型的主成分維數(shù)為 7，該模型的 R2=0.987 3, RMSECV=0.010 3，丹酚酸 B 模型的主成分維數(shù) 為 3，該模型的 R2=0.983 2, RMSECV=0.186 8。校正模型確立后, NIR 光譜完成 1 次測(cè)量只 需 2 min。而 HPLC 測(cè)定以上兩種成分需分別提取和測(cè)試,整個(gè)測(cè)試過(guò)程約需 4h。

3.3??? 檢測(cè)模型效果

以 PLS1 建立的校正模型對(duì) 5 份外部驗(yàn)正集樣品進(jìn)行分析。丹參酮ⅡA 的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表 1。 NIR 光譜預(yù)測(cè)值與 HPLC 測(cè)定真值的相關(guān)系數(shù) R=0.974 3。丹酚酸 B 的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表 2. NIR 光譜預(yù)測(cè)值與 HPLC 測(cè)定真值的相關(guān)系數(shù) R=0.988 6。

由上述數(shù)據(jù)可見(jiàn)，NIR 光譜預(yù)側(cè)值與 HPLC 分析值之間相關(guān)性良好,測(cè)定結(jié)果趨于一致。

3.4??? 精密度實(shí)驗(yàn)

取 1 個(gè)預(yù)測(cè)樣品,重復(fù)掃描 20 次,將所得光譜帶入建立的校正模型計(jì)算含量,以考察方法 的精密度,結(jié)果丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的 RSD 值分別為 1.756%，和 1.980%，說(shuō)明儀器精密度 良好。結(jié)果見(jiàn)表 3。

表 3.丹參酮ⅡA、丹酚酸 B 精密度測(cè)試結(jié)果（n=20）%

3.5??? 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取 1 個(gè)預(yù)測(cè)樣品，每 1h 掃描一次，于 5h 內(nèi)重復(fù)掃描 5 次，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果丹 參酮ⅡA 的 RSD 值為 1.193%，丹酚酸 B 的 RSD 值為 1.869%,說(shuō)明樣品在 5 小時(shí)內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。 結(jié)果見(jiàn)表 4。

表 4.丹參酮ⅡA、丹酚酸 B 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果（n=5）%

3.6??? 預(yù)測(cè)回收率實(shí)驗(yàn)

取 5 個(gè)預(yù)測(cè)樣品,分別掃描, 將所得光譜帶入建立的校正模型,計(jì)算丹參酮ⅡA 和丹酚酸

B 預(yù)測(cè)值與 HPLC 測(cè)定的真值之間的比值(預(yù)測(cè)回收率), 丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的預(yù)測(cè)回收率

分別為 103.0% 和 99.0%。結(jié)果見(jiàn)表 5。

表 5.丹參酮ⅡA、丹酚酸 B 預(yù)測(cè)回收率結(jié)果（n=5）

4??? 結(jié)論

AOTF-近紅外光譜測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA 和丹酚酸 B 的新方法,集快速、直接、多 成分同時(shí)測(cè)定和能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析為一體,解決了復(fù)方丹參片定量分析過(guò)程中操作復(fù)雜、分 析周期長(zhǎng),不能用于在線檢測(cè)的問(wèn)題,分析結(jié)果令人滿(mǎn)意,各項(xiàng)分析參數(shù)能夠滿(mǎn)足藥品生產(chǎn)過(guò) 程中含量測(cè)定的要求,若進(jìn)一步加大樣本的數(shù)量,增加樣本的代表性,可以建立更加穩(wěn)定的模 型,為復(fù)方丹參片在線質(zhì)量控制提供有效的分析方法。另外,將美國(guó)、歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家納入 藥典的先進(jìn)分析技術(shù)應(yīng)用于中成藥的生產(chǎn)和質(zhì)量分析，使中成藥分析方法與國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng) 標(biāo)準(zhǔn)接軌,適應(yīng)了中藥現(xiàn)代化的需要。

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